股票短线杠杆怎么操作 Doric光纤光度记录法在自由活动的小鼠中进行全脑多纤维神经元活动记录_商业系统_纳米_分光镜
虽然大脑区域协同运作以调节各种行为，但能够同时监测许多大脑深部区域的技术仍然有限。在此，我们提出了一种多纤维记录方案，能够在自由活动的小鼠中同时记录来自多个大脑区域的荧光信号。我们描述了组装多纤维阵列和接插线、植入以及记录的步骤。然后股票短线杠杆怎么操作，我们详细说明了数据提取和可视化的程序。该方案能够在网络层面全面了解神经活动。
东莞富临医疗科技有限公司是 Doric Lenses 中国代理商，为中国客户供应 Doric Lenses 光电生理产品与实验室从0到1搭建。
一、在开始之前
光纤光度测定法是一种利用植入大脑的光纤记录细胞群体荧光信号的方法。该方法最初用于记录单个脑区，后来扩展到同时记录多个脑区，即多光纤光度测定法（MFP）。MFP 已被证明对监测神经网络动态很有价值，并已在许多神经科学研究中得到应用。随着其受欢迎程度的提高，现在有商业系统可实现多达 7 个位点的同时记录（例如 Doric Lenses）。然而，商业系统价格昂贵且通道容量有限。将最初的多光纤光度测定系统扩展到能够同时记录自由活动小鼠的 48 个脑区。我们采用了该系统，在雄性小鼠的性行为和攻击行为期间记录了边缘系统中的 13 个区域。在采用该系统的过程中，我们简化了设置，优化了光纤构建和植入程序，并开发了定制的 MATLAB 代码来提取记录信号。这些改进使得该方法更经济实惠且易于使用。当前的协议侧重于我们多光纤阵列组装、手术植入和记录的程序。虽然我们选择了小鼠作为动物模型，但这些方法可以很容易地应用于其他小型动物。此外，尽管本协议侧重于记录钙信号，但我们已成功使用 GRABDA 传感器记录多巴胺信号，这表明该方法在研究神经化学信号动态方面具有广泛的适用性。
展开剩余94%二、机构许可
所有程序均获得相关机构动物伦理委员会的批准，符合实验动物护理和使用指南。协议使用者必须从其相关机构获得类似许可。
三、设置多光纤记录系统
时间：2 小时
如图 1 所示，该系统使用 470 纳米的 LED 作为恒定光源。光首先通过 472/30 纳米的单波段带通滤波器，从而缩小了激发光的波长。这种激发光随后被一个 495 纳米的二向色分光镜反射，该分光镜设计为反射 495 纳米以下波长的光，而让高于该波长的光通过。从分光镜反射后，激发光穿过记录光纤，照亮像 GCaMP6 这样的神经元传感器。这些传感器产生的发射光再次穿过记录光纤，穿过分光镜，并随后被一个 535/50 纳米的单波段带通滤光片过滤。最后，经过过滤的光被相机捕捉。所记录的信号随后使用 MATLAB 提取并分析。
按照图 2 所示准备好所有组件。图 2. 多光纤光度记录系统的示意图和图片（上部）以及所有组件的列表（下部）
2. 按照图 3A 和 3B 所示，将 T-Cube LED 驱动器（LEDD1B）连接到 T-Cube 电源（KPS201）和 470 纳米 LED（M470F4）。
图 3. 多光纤光度测量记录系统的分步组装（第一部分）
（A 和 B）连接电源、LED 驱动器、LED 和 SMA-SMA 补偿线。 （C 至 E）将多模准直器安装到 XY 平移台上。 （F 至 J）将荧光滤光片安装到荧光滤光片立方体中。 （K 和 L）将 10 倍物镜安装到荧光滤光片立方体上。 （M 至 Q）将 SMA 光纤适配板安装到荧光滤光片立方体上。 3. 将 SMA-SMA 光纤跳线（型号：M59L01）连接到 470 纳米的发光二极管上（图 3A）。 4. 将多模准直器（型号：F950SMA-A）插入 SM1 螺纹适配器（型号：AD15F）中，并用六角扳手固定（见图 3C 和 3D）。 5. 将适配器和准直器连接到 XY 平移台（ST1XY-S）上（图 3E）。 6. 取下动态荧光滤光片立方体（DFM1）的插件，并用六角扳手将其拆卸（图 3F 和 3G）。 7. 将 495 纳米的二向色分光镜（FF495-Di03-25×36）放入拆卸后的滤光块（图 3G）中，然后重新组装滤光块。 8. 使用扳手（型号 SPW602）将滤光片盒上的固定环取下（见图 3H）。 9. 将 472/30 纳米和 535/50 纳米的单波段带通滤光片（FF02-472/30-25 和 FF01-535/50）分别安装到滤光片立方体上，并用固定环固定（图 3H 和 3I）。
图 1. 多光纤光度测量记录系统的概览以及记录过程中的一帧示例
（A）该系统采用 470 纳米的 LED 作为恒定光源。光线首先通过 472/30 纳米的单波段带通滤光片，从而缩小激发光的波长。此激发光随后被 495 纳米的二向色分光镜反射，该分光镜设计用于反射 495 纳米以下波长的光，而让高于该波长的光通过。从分光镜反射后，激发光穿过记录光纤，照亮诸如 GCaMP6 这样的神经元传感器。这些传感器产生的发射光再次穿过记录光纤，通过分光镜，并随后被 535/50 纳米的单波段带通滤光片过滤。最后，经过过滤的光被相机捕获。所记录的信号随后使用 MATLAB 提取并分析。 （B）来自 MFP 记录会话的一个示例帧显示测试小鼠自由地与入侵者互动。 将滤光块的插入件和底座耦合，并安装端盖（SM1CP2M）（图 3I 和 3J）。 关键：二向色分光镜和带通滤光片是易碎部件，必须极其小心地处理，最好在清洁环境中操作。用户应避免接触过滤器表面，以防污染。 10. 使用 SM1 到 RMS 适配器（SM1A3）将奥林巴斯 PLN 10X 物镜（1-U2B223）连接到滤光块上（图 3K 和 3L）。 11. 将 SMA 光纤适配器板（SM1SMA）安装到 SM1 螺纹 30 毫米笼式板（CP33）上（图 3M 和 3O）。 12. 将四根笼式组件杆（ER4-P4）插入 30 毫米笼式板（图 3P）。 13. 将 24 英寸的滑套式透镜管套（SC1L24）切成两段较短的：一段为 4 厘米，另一段为 5 厘米。 14. 用一个 4 厘米的滑套式透镜管盖盖住 10×物镜，并将滤光块连接到笼板上（图 3P 和 3Q）。 15. 将相机的原镜头更换为带有外置 C 型卡口螺纹和外置 SM1 螺纹（SM1A39）的适配器。然后，将适配器连接到 SM1 螺纹的 30 毫米笼板上（图 4A - 4D）。
图 4. 多光纤光度测量记录系统的分步组装（第二部分）
（A-D）将相机与 30 毫米笼式板连接起来。 （E-I）将相机安装到 XY 平移台上。 （J-M）将两个 XY 平移台与荧光滤光块连接起来。 （N）将 SMA-SMA 光纤跳线连接到多模准直器上。 注意：配备可调帧率（FPS≥25）和曝光时间设置的相机适用于此目的。 16. 使用 SM1 转接器（SM1T2）将消色差双合透镜（AC254-060-A-ML）安装在 XY 平移台上（图 4E - 4G）。 17. 在 XY 平移台的另一侧添加一个额外的 SM1 耦合器（图 4G）。 18. 在 XY 平移台上安装四个笼式组件支架，并用一个 5 厘米的滑套式透镜管盖罩住消色差双合透镜（图 4H）。 19. 按照图 4H 和 4I 所示，将 XY 平移器与相机组装在一起。 20. 通过 SM1 转接器将两个 XY 平移台与滤光块连接起来（图 4J - 4M）。 21. 将 SMA-SMA 光纤跳线连接到多模准直器（图 4N）。 22. 启动相机，并使用千兆以太网供电注入器（TL-PoE150S）将其连接到计算机。 23. 安装 StreamPix 或任何用于相机操作和录制的视频录制软件。 注意：理想的录制软件应具备同时管理至少三台相机的能力，提供为每台相机调整曝光时间和帧率的选项，并能够为所捕获的每张图像生成时间戳。 24. 多光纤记录系统现已准备就绪。
四、3D 打印头部固定环和装置
所需时间：8 小时
这种固定头部的装置使我们能够在不麻醉的情况下固定实验小鼠的头部以连接和断开补丁线。该装置由 Dmitry Rinberg 实验室设计，您可以从相关链接下载文件。同样的文件也可以在补充材料中找到。 注意：所有补充材料均可在指定链接获取。
使用 3D 打印机打印每个组件。我们使用的是 3D 打印机和 1.75 毫米的 PLA 线材。
五、3D 打印光纤抛光盘
所需时间：5 小时
图 5 展示了抛光盘的设计。该抛光盘用于抛光光纤阵列的端部。其最初发表于参考文献中。如需 CAD 文件，请向相关研究人员索取。
图 5. 抛光盘的尺寸（单位：毫米）
使用 3D 打印机打印抛光盘。我们使用了Form 2 SLA 3D 打印机和透明树脂（RS-F2-GPCL-04）。
六、安装 MATLAB 和所需的工具箱
时间：30 分钟
从 https://www.mathworks.com/products/matlab.html 下载 MATLAB 2023a。需要许可证。
安装 MATLAB 图像处理工具箱和 MATLAB 生物信息学工具箱。
七、分步方法详情
01.组装多光纤阵列
时间：2 天
本节描述多光纤阵列的准备。
0101.设计多光纤阵列
a.用于构建多光纤阵列的 MT 插芯从相关供应商购买。
注意：供应商提供多种不同的插芯配置，详情请见指定链接。每种插芯类型的尺寸也可在供应商网站获取。例如，48 通道插芯（带靴型 MT 插芯 48 F，货号 12599）的图纸可在此处找到指定链接。（这两个 PDF 文件可在补充材料中找到）
b.根据感兴趣区域（ROI）和所选插芯的尺寸确定要使用的通道以及每根光纤的长度。
注意：在我们的示例中，我们选择了 12 个特定的大脑区域进行多光纤记录。图 6 显示了每个记录区域的 Bregma 坐标以及在 MT 插芯中选择的相应通道。
关键：MT 插芯的通道之间中心到中心的固定间距为 250 微米，可能无法精确瞄准所有 ROI。您可以选择定制一个套圈，并使用高分辨率 3D 打印机将其打印出来。见问题 1。
图 6. 图表展示了在 48 通道的 MT 接头中选定的通道，这些通道用于针对边缘系统中的 12 个脑区。
在中脑导水管周围灰质外侧区植入了一根额外的 100 微米光纤。坐标以 Bregma 为基准（单位：毫米）。LSv，侧隔的腹侧部分；MPN，前侧下丘脑核；BNSTp，终纹床核的后部；AHN，前下丘脑；DMH，背内侧下丘脑；VMHvl，腹内侧下丘脑的腹外侧部分；PMv，前乳头体核的腹侧部分；MeAa，内侧杏仁核的前部；MeApd，内侧杏仁核的后背侧部分；PA，杏仁核后部；CoAp，杏仁核皮质后部；SUBv，腹侧下托；lPAG，中脑导水管周围灰质外侧区。改编自参考文献。
0102.光纤的准备与插入
a.准备所需材料（图 7A）。将光纤切割刀（FC-6S）的刀片调整到适合切割 100 微米光纤的位置（图 7B）。
图 7. 多光纤阵列组装的关键步骤
（A）用于组装多芯光纤阵列的工具。 （B）调整光纤切割器的刀片，找到适合 100 微米光纤的位置。 （C）将光纤装到光纤切割器上并测量其长度。 （D）用一小段胶带处理光纤。 （E）切割后的 100 微米光纤示意图。 （F）代表 MT 插芯不同侧面的图像。 （G）将光纤插入选定的通道。注意插入方向。
b.使用乙醇和低纤维擦拭纸（例如，Kimwipes 轻柔任务擦拭纸）清洁 100 微米光纤（UM22-100）。
c.将 100 微米光纤装到光纤切割器上。
d.用尺子测量并调整光纤的长度。通常，对于大多数小鼠脑区，2 厘米的长度就足够了（图 7C）。
e.关闭光纤切割器的盖子。
f.将刀片来回移动多次，刮擦并破坏涂层。然后，将刀片推到底部，干净利落地切割光纤。
g.用一小段胶带小心地拾起切割后的光纤（图 7D）。
h.在 5 倍显微镜（例如，Stemi 2000）下检查光纤的切割端，确保其表面平滑且均匀，如同镜面。我们将此端称为平滑端（图 7E）。问题 2。
注意：光纤的外层涂层可能会有轻微破损，但这通常不会影响记录质量。
i.将准备好的光纤插入 MT 插芯的目标通道中，确保光纤的平滑端插入 MT 插芯的实心端（图 7E - 7G）。
j.重复步骤 2c - i 对剩余的光纤进行操作，直至所有光纤都插入对应的通道。
0103.纤维对齐
a.使用记录最靠腹侧脑区的最长突出纤维作为参考通道。
b.计算参考通道与其他所有通道之间的长度差（图 8A）。
关键：考虑到小鼠颅骨的厚度和曲率，需在所有通道的长度上额外增加 0.5 - 1 毫米。例如，如果最深的记录点位于颅骨表面以下 5.5 毫米处，则最长的光纤应从 MT 柱状套管的空心端突出 6 - 6.5 毫米。
图 8. 多光纤阵列对准的关键步骤
（A）选择参考通道，并计算参考通道与其他通道之间的差值。 （B）在将未完成的多芯光纤阵列固定到夹具上之前，修剪多余的光纤。 （C）一个安装在支架上的 200 微米光纤插芯组件。 （D）一个由 MT 插芯和两个导向销制成的插芯夹具。 （E-H）根据参考光纤调整其他光纤的深度，使用 200 微米光纤将这些光纤向上推。
c.将装有光纤的 MT 插芯固定到夹具上，然后将夹具固定到立体定位架上（图 8D 和 8E）。
注意：在我们的案例中，我们将 MT 插芯用胶带固定在玻璃移液管夹具（型号 1975）上，以固定装有光纤的 MT 插芯。玻璃移液管夹具是立体定位系统（型号 1900）的一个附件。
关键：避免留下过长的多余光纤，因为它们可能在调整过程中粘在胶带上。在将 MT 插芯固定进行调整之前，先修剪光纤（图 8B）。
d.将一根 200 微米的光纤（例如 R-FOC-L200C-50NA）固定在支架上。这根单光纤将用于调整 MT 插芯内每根 100 微米光纤的突出长度（图 8C 和 8E）。
e.缓缓升起装有光纤的 MT 插芯，直至插芯的下边缘与所需参考光纤（阵列中最长的光纤）的长度（例如 6.5 毫米）相等。再次将 z 轴归零（图 8G）。
f.再次将 MT 插芯稍稍升起，直至所有预装的 100 微米光纤都高于 200 微米光纤的尖端。
g.移动 MT 插芯的 x 轴和 y 轴位置，将参考光纤置于 200 微米光纤上方。
h.轻轻放下参考光纤，直至其到达 z 轴的零点，即光纤处于所需长度（图 8G）。
关键：确保 200 微米光纤笔直向上，其表面平整且干净，以防止多光纤阵列中 100 微米光纤的光滑端部受损。
i.将每根 100 微米光纤置于 200 微米光纤尖端上方，并将 100 微米光纤降至与参考光纤长度差对应的 z 轴坐标，该长度差由步骤 3b 计算得出。
注意：在下降过程中，200 微米的光纤会将 100 微米的光纤向上推（图 8G 和 8H）。在过程结束时，所有光纤都应达到所需的长度。
j.完成光纤长度调整后，小心地将光纤插芯从夹具上取下。
k.将装有光纤的 MT 接头放置在一条胶带或一块黏土上，存放在培养皿中（图 9A）。
图 9. 将光纤与 MT 插芯进行粘接的关键步骤
（A）所需工具和材料。 （B）在培养皿中混合环氧树脂。 （C）一支装有混合环氧树脂的注射器。 （D）从插芯的前端向多芯阵列中注入混合环氧树脂。 （E）插芯的前端和实心端都涂有环氧树脂。 （F）导向销的孔内不应有环氧树脂。
0104.将光纤粘贴到 MT 插芯上
a.将双组份环氧胶粘剂（AB9112-2.5G）充分混合（图 9B）。
注意：如果固化胶粘剂存放时间过长且含有固体碎片，可在 50°C 下轻轻加热约 2-5 分钟。这样可溶解所有碎片。
b.使用 1 毫升注射器（BD30659）抽取适量环氧胶粘剂。
c.将 22 号或更大号的针头（BD305155）连接到注射器上（图 9C）。
d.紧握针头，缓慢将环氧胶粘剂注入 MT 插芯的前端，直至空心端的孔被填满（图 9D）。
e.在 MT 插芯的实心端滴一滴环氧胶粘剂，确保滴液覆盖所有光纤（图 9E）。此步骤有助于在光纤抛光过程中防止光纤受损。
关键：确保环氧胶粘剂不进入光滑端用于连接 MT 插芯与记录跳线匹配插芯的两个大孔（图 9F）。
暂停点：等待 24 小时，直至环氧胶粘剂完全固化。
0105.光纤抛光
a.准备如图 10A 和表 1 所示的必要材料。
图 10. 多光纤阵列抛光的关键步骤（A）用于抛光多光纤阵列的工具和材料。（B）在 MT 插芯的实心侧修剪多余的环氧树脂和光纤。（C）带有 3D 打印光纤抛光盘的插芯。（D）使用小型锯齿夹固定 MT 插芯。（E）在光纤抛光过程中清洁孔洞。
表 1. 光纤抛光所需材料
b. 使用剃须刀片或剪刀修剪掉插芯上多余的环氧树脂和纤维（图 10B）。
c. 将 MT 插芯装到 3D 打印的抛光盘上（图 10C）。
注意：多次使用后，抛光盘可能会失去对插芯的夹持力。您可以打印一个新的抛光盘，或者在插芯侧面滴一滴氰基丙烯酸酯胶水（例如胶水）来固定插芯。
d. 使用小型锯齿状夹子（货号 13003-10）夹住插芯（图 10D）。
注意：由于插芯是塑料制成的，在抛光过程中要保护好它，用胶带覆盖夹子的锯齿（图 10D）。
e. 将 P400 砂纸（Wetordry 砂纸，P400）放在平坦的固体表面上，对插芯进行抛光（图 10D）。
关键：抛光过程中要定期用乙醇清理碎屑，并检查 MT 插芯的实心端，确保只去除多余的环氧树脂，而不会损坏插芯本身。
f. 当只剩下薄薄一层环氧树脂时，用乙醇和低纤维擦拭布清洁表面。然后，使用压缩空气喷雾器（例如 Dust-Off）清除卡在孔中的碎屑（图 10E）。继续使用 5 微米砂纸（LF5P）抛光套圈，直至去除所有多余的环氧树脂。
h. 用乙醇清洁表面，并确保孔洞清晰。
i. 在 1 微米砂纸（LF1P）上滴乙醇，继续抛光套圈。当表面变得光滑且有光泽时停止。
j. 用乙醇清洁表面，并确保孔洞清晰。
k. 在 0.3 微米砂纸（LF03P）上滴乙醇，继续抛光套圈以进一步细化表面。
02.组装并抛光匹配的跳线
时间：2 天
本节描述了组装与多芯光纤阵列匹配的多芯跳线的步骤。
将 MT 插芯的靴套（型号：Boot_48F MT，货号：12599）套在定制跳线上（Doric 镜片，订购信息见补充材料）（图 11A）。
图 11. 跳线组装的关键步骤（A）一根两端松散的跳线，一端连接靴套，另一端连接 MT 型插芯。（B）在 5 倍显微镜下将跳线的单根光纤插入 MT 型插芯的选定通道中。（C）将 MT 型插芯与靴套连接起来。（D 和 E）在 MT 型插芯的前端和实心端各滴一滴环氧树脂。（F）修剪多余光纤并抛光后的光纤跳线。
将跳线的每根光纤从 MT 接头（型号：Ferrule_48F MM MT，货号：12599）的空心端插入到指定的通道中。此操作应在显微镜下进行。使用尖端精细的镊子可以简化插入过程（图 11A 和 11B）。
修剪多余的光纤，并将 MT 接头与护套连接（图 11C）。
按照“组装多芯光纤阵列”部分第 4 步和第 5 步中所述的相同步骤，固定光纤并抛光连接跳线的 MT 接头的实心端（图 11D - 11F）。
03.手术和多芯光纤阵列植入
本节概述了病毒注射和多芯光纤阵列植入的步骤。
使用适当浓度的异氟烷麻醉小鼠，并将其置于立体定位仪中。
关键：在整个手术过程中，必须持续监测小鼠的呼吸情况。我们建议在手术过程中逐渐将异氟烷浓度从 1.5% 降至 1%，以防止过度麻醉动物。
切开皮肤，露出颅骨表面，并确保其平整（图 12A）。
图 12. 手术期间多光纤阵列植入（A）切开皮肤以暴露颅骨表面。（B 和 C）使用小钻头在颅骨上钻孔。（D 和 E）将组装好的多光纤阵列固定在支架上，并将光纤插入颅骨上的钻孔中。比例尺，2 毫米。（F 和 G）用牙科水泥固定植入的多光纤阵列，并在颅骨上放置一个头部固定环。
根据目标区域的坐标，在颅骨上使用小钻头（例如，#79，10WS79-550FL）钻孔（图 12B 和 12C）。
使用微量注射器（例如 Nanoliter 2020 注射器）缓慢（例如，流速：20 纳升/分钟）向每个感兴趣的脑区注入少量病毒（例如，80 纳升 AAV1-CAG-Flex-GCaMP6f-WPRE.SV40，100835-AAV1）。根据具体脑区的需要调整体积和流速。
注射后，将注射针头保持在原位至少 5 分钟，以使病毒扩散，然后缓慢拔出针头。
重复步骤 13 至 14，将病毒注入所有选定的大脑区域。
将组装好的多芯光纤阵列固定到支架上（图 12D）。
使用最长的光纤来定位多光纤阵列。一旦最长的光纤被正确地置入颅骨上的相应孔中，所有其他光纤都应紧密地插入预先钻好的孔中（图 12E）。问题 3。
将多纤维阵列植入病毒注射深度上方约 200 微米处。
使用牙科粘固剂（例如，C&B Metabond 快速粘固剂系统，货号 S380）将植入的多纤维阵列固定在颅骨表面（图 12F）。
将头固定环置于颅骨上，并用牙科水泥固定（图 12G）。
暂停点：等待三周以使病毒表达。
图 13. MFP 记录的关键步骤（A）调整 SMA 光纤板的位置，直至记录跳线端清晰对焦。（B）调整前记录跳线端的模糊视图。（C）调整后记录跳线端的清晰视图。（D）固定头部的小鼠在跑轮上。（E）附有跳线的 MT 插芯，插入了两根导向针，并贴有一块封堵胶带。（F）将记录跳线与植入的多光纤阵列连接。
将跳线（带有 MT 接头）未连接的一端朝向房间的灯光。沿着 30 毫米笼系统的杆调整 SMA 光纤适配器板（图 13A），直至跳线的光纤端处于清晰对焦状态（图 13B 和 13C）。
注意：如果光纤束的图像未在框架内居中，请调整直接连接到相机的 XY 位移器上的螺丝以进行正确对齐。
打开 LED 电源，并将其切换至“CW”模式以输出恒定的激励光。
要测量记录光纤接头的输出功率，请使用功率计（SM1T2 和 S120C 型号）。
a. 将功率计的量程设置为 800 微瓦，波长设置为 470 纳米。
b. 用唇形盖住传感器以将功率计清零。
c. 完成校准后，将记录光纤接头对准传感器以获取功率读数。
将 LED 的电源进行调整，确保每个通道的光强度约为 30 微瓦。整体输出功率应等于通道数量乘以 30 微瓦。
注意：如果即使电源处于最大输出时，总光输出仍低于期望的功率水平，请考虑调整与 LED 相连的 XY 位移器上的螺丝。这种调整有助于更好地校准激发光和跳线，从而实现最佳性能。
再次，将记录接头朝向房间灯光。使用细针逐个阻塞通道，使图像中光纤端的位置与 MT 接头中光纤的位置相匹配，从而确定目标脑区。
关键：步骤 23 至 27 每次重新连接跳线至 MFP 系统时都需要执行。
使用 3D 打印的头部固定系统固定小鼠的头部（图 13D）。
将两根平头导向销（货号 12766）插入连接跳线的 MT 型插芯中，并用一段胶带固定住导向销，防止其移动（图 13E）。
用乙醇和低纤维擦拭布清洁植入式多光纤阵列的表面以及连接跳线的 MT 接头。
将跳线与植入的多芯光纤阵列连接起来（图 13F）。
调整相机的曝光时间和增益，以确保所有通道的光强度都在相机的动态范围内。
注意：对于我们的记录，通常将曝光时间设置为 20 至 30 毫秒，增益范围为 250 至 400。需要注意的是，高增益设置可能会导致背景噪声。在 Mono8 格式中，每个像素的值范围为 0 至 255。理想情况下，所有通道在基线时的光强度应在 30 至 100 之间。然而，由于病毒表达和光纤放置的差异，要使所有通道达到相似的强度水平往往具有挑战性。因此，根据经验，基线信号在 15 至 180 之间都是可以接受的。
视频的帧率应根据荧光信号的时间动态来设定。对于 GCaMP 记录，每秒 25 帧就足够了。
使用加速光固化材料（例如，Flow It ALC 流动性复合材料）或胶带（图 13F）固定连接，以确保连接稳固。
将小鼠放入记录室，开始行为测试并进行记录。
关键提示：强室光（红外线或可见光）会影响 MFP 信号。建议使用低强度的室光。
图 14. 从示例数据集中提取数据及数据说明（A）视频中显示多芯记录跳线末端的一个示例帧。（B）调整对比度后的示例帧。（C 和 D）基于（A 和 B）中的示例帧生成的多个二值掩码（C）以及掩码的顺序（D）。（E）来自示例数据集的同时记录的 GCaMP6f 轨迹（ΔF/F）。IPAG 使用单独的单芯光纤记录。改编自参考文献。
注意：您可以为每个通道指定名称（例如，大脑区域），以便于识别。默认情况下，在 MATLAB 代码中，通道被命名为“通道 1”、“通道 2”……
只要跳线保持与 MFP 设备连接，每个记录跳线的掩码只需生成一次。
如果您的视频格式为 mp4，请在 MATLAB 中打开 MFR_Extraction_for_mp4.m。如果您的视频格式为 seq，请打开 MFR_Extraction_for_seq.m。
第 43 步中的 MATLAB 代码将生成一个 MATLAB 数据文件，其中包含每个视频帧中每个感兴趣区域（ROI）的平均记录信号。这些感兴趣区域基于自动生成的掩码（图 14D）。所有通道的记录信号将以 MATLAB 图形的形式绘制出来以供可视化（图 14E）。
使用提取的信号进行各种分析，例如构建事件后直方图、计算平均响应或检查不同区域之间的相关性。有关示例分析和相关 MATLAB 代码，请参阅参考文献。
关键：在计算 ΔF/F（存储在 Lfilter 中）时，我们使用 msbackadj 函数并采用 10 秒窗口来校正光漂白效应。但请注意，这种方法可能会去除分钟级的缓慢瞬态信号。如果保留和分析这些缓慢瞬态信号对您的研究至关重要，建议使用原始数据（存储在 LMag 中）进行进一步分析。
八、预期结果
本协议描述的多光纤光度测定法为同时记录自由活动动物多个脑区的神经活动提供了一种简单且低成本的解决方案。尽管跳线包含数十根光纤，但由于单根光纤直径较小（100 微米），其重量轻且灵活，不会严重妨碍动物活动。实验表明，记录动物可正常执行攻击或跨骑等同种社会行为。然而，由于当前 MFP 系统缺乏通讯器，跳线可能随时间推移缠绕，因此建议记录时间限制为 1–2 小时，并需密切监控。记录时可能观察到光纤末端光强波动，但 ΔF/F 信号与单通道光纤光度法结果相当。
九、限制
当前协议存在以下局限性：脑区差异：不同脑结构的细胞密度与病毒嗜性偏好可能不同，需调整病毒血清型、滴度及注射量以实现跨区基线一致。针对不同细胞类型的研究需复杂病毒策略。
空间限制：MT 插芯的预置配置可能限制对某些脑区组合的访问。
信号来源：荧光蛋白（如 GCaMP）可能表达于轴突，导致通道信号混合目标区域细胞与其他区域输入的信号。
手术时长：逐个脑区注射病毒导致手术时间较长。可通过使用转基因动物（如 Cre 驱动品系与 Cre 依赖性 GCaMP 报告品系杂交）表达传感器来优化。
参考通道缺失：当前 MFP 系统仅含 470 nm 通道，缺乏 405 nm 参考通道，可能限制运动伪影校正。建议在非目标脑区表达 GFP 以监测伪影。关于 405 nm 通道的设置方法，可参考相关研究中概述的光路设计。
十、故障排除
01.问题 1
US Conec 可用的光纤套管可能无法满足实验要求。与步骤 1b 相关。
02.潜在解决方案
可根据感兴趣区域（ROIs）设计定制光纤套管，并使用 3D 打印机打印。阵列中的孔也可以使用钻床加工。我们已成功设计并生产了用于 200 微米光纤的套管，但发现由于可用钻头的限制，生产 100 微米光纤的套管较为困难。值得一提的是，定制的 200 微米多光纤阵列会造成更大的组织损伤。由 200 微米光纤组成的跳线也比含 100 微米光纤的跳线更硬更重，从而会更限制记录动物的活动。如果使用 200 微米阵列，在一只动物身上记录点的数量不应超过 12 个。
03.问题 2
切割后光纤质量差。与步骤 2h 相关。
04.潜在解决方案•
刀片的上边缘在多次切割后可能会附着碎屑。请用乙醇和低绒布轻轻擦拭刀片进行清洁。
刀片的上边缘也可能变钝。旋转刀片以充分利用刀片的整个长度。
05.问题 3
100 微米的纤维很细且柔韧。针对深部脑区的纤维有时会略微弯曲。与步骤 17 相关。
06.潜在解决方案
在切割前，用一个重物（约 20 克）将纤维垂直悬挂起来，有助于将其拉直（图 15）。
图 15. 用重物拉伸 100 微米的纤维
07.问题 4
视频显示的是雪花状噪声而非插线端。与步骤 36 有关。
08.潜在解决方案
Piotr 的计算机视觉 MATLAB 工具箱中的原始工具箱已过时，与 MATLAB 2023a 不兼容。我们已更新代码。请使用当前协议补充材料中的“behaviorAnnotatoin”文件夹。
09.问题 5
生成的掩码遗漏了部分目标通道。与步骤 42 有关。
10.潜在解决方案
如果某个通道太暗，算法可能无法自动检测到它。为防止这种情况，将记录插线端对准光源照亮所有目标通道，然后再将记录插线连接到测试动物。录制一段简短的视频，并使用此视频生成掩码。
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